提高工业微生物对低pH环境的耐受性将有利于降低生物发酵的成本，然而，微生物的耐酸性是一个复杂的性状，涉及多基因互作。最近的研究表明，三种关键的耐酸机制，包括质子消耗、蛋白质保护和活性氧清除，对于增强大肠杆菌的耐酸性至关重要。

【SynBioCon】获悉，近日，来自华南理工大学的林章凛、杨晓锋团队在《Microbial Biotechnology》平台发表研究“Toehold Switch-Based Approach for Engineering Acid-Tolerance Modules to Enhance Production Robustness of Industrial E. coli Strains at Low pH”利用“立足点开关”(toehold switch)构建了一组耐酸模块，令产赖氨酸的大肠杆菌能够在 pH 5.5 下保持与pH6.8下的出发菌株相当的赖氨酸滴度和转化率。

机制概述：酸响应模块由两个质粒构成，一个质粒带有酸响应启动子（酸触发模块），表达4个针对不同立足点开关的触发RNA，另一个质粒带有4种立足点开关（耐酸模块），分别表达4个与耐酸有关的基因。

细节如下：

研究首先在pCOLADuet-1质粒上构建了一个由4个酸响应启动子及其下游触发RNA表达框构成的酸触发模块。4个酸响应启动子表达产物为4种针对不同立足点开关的触发RNA。为了保证立足点开关的表达效果，研究首先对 触发RNA 和 立足点开关 进行了基于红色荧光蛋白的筛选，筛选能在低pH情况下显著增强下游基因翻译的触发RNA-立足点开关对，并在触发RNA-立足点开关不变的情况下，从酸响应启动子文库中，筛选了不同强度的酸响应启动子。

随后将不同强度的启动子、不同的触发RNA-立足点开关对、不同的耐酸基因合并成耐酸模块文库，耐酸基因因机制差异被分为4个功能组：质子消耗系统（gadB、gadE、adiC、ybaS 和 rcsB）、蛋白质保护系统的伴侣（hdeB、degP、dps、spy 和 DS-YlHD），细胞膜修饰和氧化还原稳态系统（sthA、cfa、osmY 和 soxR），过氧化物清除系统（sodA、sodB、trxC、 katE），考虑到过氧化物清除通常涉及超氧化物歧化酶与过氧化氢酶的联合作用，因此过氧化氢酶KatE被置于酸启动子下共同整合至耐酸基因表达质粒中）。

通过自动化高通量平台构建上述质粒（因为立足点开关的种类、位置、不同的耐酸基因等因素，组合表达文库的容量约为7.68 × 10^4），研究将耐酸文库转入产赖氨酸的工程大肠杆菌进行测试。

在 pH 4.5 条件下对含有耐酸模块组合的MG1655株进行了 10 轮文库选择，共分离 1140 个菌落，并在微孔板中以 pH 5.5 进行细胞生长测定，最终 OD(600)比率和最大增长率 μ(max)，最后发现， 26 个组合生长超过野生型菌株 120% 。为了排除培养过程中的突变，研究将 26 种耐酸质粒组合重新转化到大肠杆菌 MG1655 中。其中 9 个再转化菌株表现出相比野生型更强的耐酸性。

将所得9种合成耐酸模块引入工业赖氨酸生产菌株大肠杆菌 SCEcL3，分批补料发酵后发现2种组合令SCEcL3菌株的赖氨酸产量与葡萄糖转化率限制提升。

针对2个耐酸模块的基因表达情况分析表明，2个模块包含编码周质伴侣的 degP 和编码转氢酶的 sthA。周质伴侣的 degP被筛选出来或许意味着质子从外部环境流入时，周质充当抵御外部压力的第一道防线，因此周质蛋白变得更加脆弱，需要更多伴侣蛋白的保护。转氢酶 SthA 通过催化 NADH 和 NADPH 之间的可逆转化，在平衡细胞辅因子中起着至关重要的作用。

综上，研究设计的策略为提高中等酸性条件下工业菌株的稳健性和生产力提供了一个有价值的探索方向。