在生物制造领域，寻找可持续、非粮碳源以替代传统的糖类原料一直是科研与产业追求的核心目标。琥珀酸生物发酵法虽已实现商业化，但主流工艺严重依赖玉米、甘蔗等粮食糖类作为原料，存在“与人争粮、与粮争地”的伦理与资源困境。因此，开发基于非粮、可再生原料，尤其是利用二氧化碳等一碳资源的琥珀酸合成技术，对于化工行业的脱碳与可持续发展至关重要。甲醇，作为一种简单的C1化合物，可由工业捕获的CO2通过催化加氢或电化学还原“绿色”合成，其生产可与可再生能源耦合，实现碳循环。因此，以甲醇为碳源实现琥珀酸生物合成具有重大意义。

近日，一项发表于《Bioresource Technology》的研究取得了突破性进展：奥地利维也纳自然资源与生命科学大学的研究团队成功改造了甲基营养型酵母 Komagataella phaffii，使其能够高效地将C1化合物甲醇转化为重要的平台化学品琥珀酸，最终产量突破100 g/L。这项成果不仅为琥珀酸的绿色生产开辟了一条全新路径，更展示了以甲醇为代表的C1原料在构建未来循环生物经济中的巨大潜力。

一、打通“出口”——寻找并验证高效转运蛋白

为提升K.phaffii的琥珀酸输出能力，该研究引入了两种经异源宿主验证功能的转运蛋白：SpMae1与AnDct-02。摇瓶培养实验表明，在甲醇诱导型PDAS1或组成型PGAP启动子驱动下，表达任一转运体均能有效提升琥珀酸产量。综合结果显示，转运蛋白AnDct-02是更优的选择。其在两种启动子下均能稳定实现约1.5 g/L的琥珀酸产量，性能显著优于SpMae1。相比之下，转运蛋白SpMae1的表达高度依赖启动子类型，其产量在PDAS1驱动下可比PGAP驱动时提高2.5倍，说明其调控更为关键。此外，将转运蛋白SpMae1与AnDct-02进行共表达，并未带来琥珀酸产量的进一步提升。这表明在实验条件下，琥珀酸输出可能已接近上限，或存在其他代谢瓶颈。基于上述结果，后续研究选择性能更优、调控更稳健的AnDct-02作为主要转运体。

二、初试放大——从摇瓶到生物反应器的挑战

为评估工程菌株的放大生产潜力，研究人员在1.5 L生物反应器中进行补料分批发酵，精确控制了溶氧、pH及甲醇流加等关键参数。与摇瓶结果显著不同，在优化的生物反应器条件下，苹果酸取代琥珀酸成为主要产物。表达AnDCT-02的菌株产量最高，苹果酸、琥珀酸和富马酸的产量分别为 44.2 g/L、8.8 g/L、4.0 g/L，但其生物量较低。表达SpMAE的菌株各项产量均较低，但生物量更高。两者共表达进一步提高了苹果酸产量（至61 g/L），但琥珀酸产量仅小幅增加。结果表明，这两种转运蛋白对苹果酸的输出存在偏好，可能在细胞内苹果酸进一步转化为琥珀酸之前就将其排出，从而改变了代谢物分布。该实验成功证明了工程化K.phaffii在可控发酵体系中从甲醇生产二羧酸的能力，展现了其生物制造的潜力。

三、代谢导航——引入异源途径，重塑碳流

为将代谢流向琥珀酸，研究在细胞质中构建了异源还原性TCA循环。直接在生物反应器中测试发现：（1）单独过表达苹果酸脱氢酶（CgMDH）能大幅提升苹果酸MA产量（如AnDCT_MDH菌株达77.5 g/L），但对琥珀酸产量影响不大。（2）单独过表达富马酸酶（PkFUM1）则能有效增加富马酸FA的积累。

在此基础上，研究人员构建了同时表达CgMDH、PkFUM1和富马酸还原酶（TbFRD1c）以及转运蛋白的菌株。这一完整途径带来了根本性转变：（1）琥珀酸产量突破性增长：AnDCT_MDH_FUM_FRD和SpMAE_MDH_FUM_FRD菌株琥珀酸产量分别达到 106.9 g/L 和 100.5 g/L。（2）此前积累的苹果酸水平急剧下降至约5.5 g/L，富马酸也维持在极低水平，表明碳流被高效导向琥珀酸。（3）菌株比生产率提升约10倍，且活力保持良好。该结果充分证明了异源rTCA循环策略在K.phaffii中高效生产琥珀酸的有效性。

四、精益求精——“自上而下”寻找最小高效基因集

为确定高产琥珀酸SA所需的最简基因组合，研究采用自上而下的策略，从表达异源转运体AnDCT-02及三种TCA循环酶（CgMDH、PkFUM1、TbFRD1c）的完全工程化菌株出发，逐一敲除基因进行分析。关键发现如下：

（1）敲除转运体AnDCT-02（菌株MDH_FUM_FRD）导致琥珀酸产量几乎完全丧失（<0.3 g/L），表明转运体对琥珀酸的有效分泌至关重要。

（2）仅保留转运体与富马酸酶（AnDCT_FUM），琥珀酸产量仍较低（17.6 g/L），代谢以分泌苹果酸和富马酸为主。

（3）仅保留转运体与富马酸还原酶（AnDCT_FRD），琥珀酸产量显著提升至42.6 g/L，表明TbFRD1c能有效驱动代谢流向琥珀酸。

（4）同时表达转运体、富马酸酶和富马酸还原酶（AnDCT_FUM_FRD），即可实现与完全工程菌株相似的高琥珀酸产量（105.5 g/L），而无需苹果酸脱氢酶（CgMDH）。

该研究表明在K.phaffii中高效合成与分泌琥珀酸，依赖于转运体（AnDCT-02）、富马酸酶（PkFUM1）和富马酸还原酶（TbFRD1c）的协同作用，苹果酸脱氢酶在此条件下并非必需。

本文突破了琥珀酸生产依赖糖基原料与天然产酸菌的传统范式，通过合成生物学手段，将甲基营养酵母K.phaffii改造为高效的C1细胞工厂，实现了从甲醇到琥珀酸（>100 g/L）的高效转化。其深远意义在于：验证了“CO₂→甲醇→化学品”的可持续技术路径，为生物制造摆脱粮食竞争、直接利用无机碳源提供了关键案例。研究采用“自上而下”策略，精准定位了转运蛋白-延胡索酸酶-延胡索酸还原酶这一最小功能核心，为复杂途径理性设计树立了典范。